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BIOCHANNEL 科普 | 雜交瘤細胞如何建立

什么是雜交瘤技術(shù)?

雜交瘤技術(shù)是一種用于生產(chǎn)單克隆抗體的生物技術(shù),由Georges Kohler和César Milstein于1975年發(fā)明,并因此獲得了1984年的諾貝爾獎。該技術(shù)的基本原理是通過(guò)融合兩種細胞而同時(shí)保持兩者的主要特征:一種是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞(B淋巴細胞),另一種是具有無(wú)限分裂能力的小鼠骨髓瘤細胞。

具體來(lái)說(shuō),B淋巴細胞在受到特定抗原刺激后,可以大量增殖并分泌針對該抗原的特異性抗體,但這些細胞在體外環(huán)境下存活時(shí)間較短;而骨髓瘤細胞則可以在培養條件下無(wú)限分裂和增殖,即具有所謂的永生性。通過(guò)將這兩種細胞進(jìn)行融合,可以形成一種新的細胞——雜交瘤細胞。這種細胞既保留了B細胞的抗體分泌功能,又具備了骨髓瘤細胞的永生性,能夠在選擇性培養基中持續生長(cháng)和繁殖。

雜交瘤技術(shù)的操作流程通常包括以下幾個(gè)步驟:

? 免疫小鼠:首先對小鼠進(jìn)行免疫接種,使其產(chǎn)生針對特定抗原的抗體。

? 分離脾細胞:從免疫后的小鼠體內提取脾臟,并從中分離出B淋巴細胞。

? 融合細胞:將這些B細胞與骨髓瘤細胞進(jìn)行融合,通過(guò)使用聚乙二醇(PEG)作為融合劑,使兩者結合形成雜交瘤細胞。

? 篩選雜交瘤細胞:將融合后的細胞在含有次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸腺嘧啶(HAT)的選擇性培養基中進(jìn)行篩選,以淘汰未融合或非目標細胞,保留能夠生長(cháng)且能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞。

? 二次篩選:進(jìn)一步通過(guò)有限稀釋法將雜交瘤細胞接種在多孔板上,每孔不超過(guò)一個(gè)細胞,通過(guò)培養讓其增值,然后檢測各孔上清液中抗體的特異性,最終確定陽(yáng)性克隆。

雜交瘤細胞的體外培養

系統的腹水法已逐漸被體外大規模培養所取代,這包括懸浮培養、微載體懸浮培養、微囊培養以及中空纖維培養等方法。這些方法不僅提高了單克隆抗體的產(chǎn)量,還便于質(zhì)量控制和標準化生產(chǎn)。

雜交瘤細胞體外培養的工藝流程一般分為以下幾個(gè)階段:

? 細胞選擇與融合:首先從免疫動(dòng)物中獲取B淋巴細胞和骨髓瘤細胞,通過(guò)PEG誘導劑進(jìn)行細胞融合,形成雜交瘤細胞。

? 篩選與克隆化:將融合后的細胞接種到含有HAT培養基的96孔板中進(jìn)行篩選,只有成功融合的雜交瘤細胞才能在該培養基中生長(cháng)。

? 工藝優(yōu)化:根據具體需求,對培養條件進(jìn)行優(yōu)化,如調整培養基成分、改變攪拌速度等,以提高雜交瘤細胞的生長(cháng)密度和抗體產(chǎn)量。

? 純化與收獲:最后通過(guò)收集培養上清液并離心去除細胞碎片,得到所需的單克隆抗體

雜交瘤技術(shù)的特點(diǎn)

1. 能夠生產(chǎn)大量均一的單克隆抗體,結構穩定且親和力較好。

2. 可以永久傳代和大規模生產(chǎn)抗體。然而,該技術(shù)也存在一些局限性:周期較長(cháng),需要經(jīng)過(guò)兩次篩選過(guò)程。

3. 存在遺傳異質(zhì)性問(wèn)題,可能影響抗體的一致性和效能。

4. 需要合適的培養基和設備維護。

總之,雜交瘤技術(shù)不僅為單克隆抗體的生產(chǎn)提供了穩定可靠的平臺,也為免疫學(xué)和生物醫學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出了重要貢獻。

注意事項

細胞損傷與保護:在高密度培養過(guò)程中,細胞可能會(huì )受到機械損傷或氧化應激的影響,需要采取相應的保護措施。

無(wú)血清培養:雖然無(wú)血清培養基可以減少雜質(zhì)污染和動(dòng)物病毒的風(fēng)險,但其適應性較弱,需要逐步馴化雜交瘤細胞。

放大與擴增:在放大培養過(guò)程中,需要考慮攪拌條件、容器大小等因素,以保證細胞的均勻生長(cháng)和抗體的一致性。


隨著(zhù)生物反應器技術(shù)的發(fā)展,雜交瘤細胞的大規模體外培養已經(jīng)取得了顯著(zhù)進(jìn)展。例如,英國Celltech公司開(kāi)發(fā)的1萬(wàn)升氣升式反應器已成功應用于單克隆抗體的生產(chǎn)。國內也有類(lèi)似規模的生物反應器用于WuT3雜交瘤細胞的培養。

總之,雜交瘤細胞的體外培養技術(shù)在單克隆抗體生產(chǎn)中發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要的作用。通過(guò)不斷優(yōu)化培養條件和工藝流程,可以有效提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量,滿(mǎn)足臨床和科研的需求。



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