【貨號】 BC-PC-HU-001

【規(guī)格】 5*10⁵個/T25培養(yǎng)瓶（常溫發(fā)貨）

【保存】 液氮保存，長期

【產品介紹】

 

【細胞簡介】

人骨髓間充質干細胞(BMSC)分離自骨髓；骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內。骨髓存在于長骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨質間的網眼中，是一種海綿狀的組織，能產生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當部分紅骨髓被黃骨髓取代，最后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。骨髓基質系統內存在的骨髓間充質干細胞是一種除造血干細胞以外的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細胞。在骨髓中，BMSC占骨髓有核細胞總數的0.001%~0.1%，含量極低。骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)條件要求較高，在培養(yǎng)過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值等條件的影響。

【收貨后處理】

T25培養(yǎng)瓶常溫運輸細胞

根據不同細胞生長特性，分為以下處理方式：

貼壁細胞：未超過80%匯合度時，將培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基收集至離心管中，留5mL完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO₂孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時，依據生長特性進行傳代或凍存，具體操作見細胞傳代和凍存步驟。首次傳代，建議1:2傳代（兩個T25）。

懸浮細胞：將T25培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中1000rpm離心3~5min，丟棄上清，加1~2mL完全培養(yǎng)基重懸，按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25），補充新鮮的完全培養(yǎng)基至4~5mL/瓶，最后放入37℃、5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

半貼壁、半懸浮細胞：?對于半貼壁半懸浮生長的細胞，懸浮細胞用離心管收集細胞懸液，1000rpm離心3~5min，丟棄上清。?貼壁的細胞未超過80%匯合度時，用5mL完全培養(yǎng)基重懸收集到的細胞沉淀，然后加回原培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。?貼壁的細胞超過80%匯合度時，根據貼壁細胞傳代方法使用0.25%胰酶消化收集；將懸浮細胞和貼壁細胞的沉淀用1~2mL完全培養(yǎng)基重懸收集到一起，混勻后，按1:2進行分瓶傳代（2個T25）。

運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

【復蘇培養(yǎng)】

從液氮中取出細胞凍存管，快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；將凍存管中的細胞懸液移至含1mL完全培養(yǎng)基的15mL離心管中，1000 rpm離心3~5min；

棄上清，用4~5mL完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種至T25培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，密切觀察細胞狀態(tài)。

【細胞傳代】 

細胞收集：?貼壁細胞：當細胞生長至培養(yǎng)瓶或皿底面的80%以上匯合度時，棄去培養(yǎng)瓶或皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次，然后添加適量的0.25%胰蛋白酶消化液至培養(yǎng)瓶或皿中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后，加入與胰蛋白酶消化液等量（或高于消化液的量）的完全培養(yǎng)基終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15mL離心管中。?懸浮細胞：直接收集培養(yǎng)瓶或皿中的細胞懸浮液轉移至15mL離心管中。?半貼壁半懸浮細胞：先參考?收集懸浮細胞，再參考?收集貼壁細胞。

離心：收集好的細胞在1000rpm條件下離心3~5min，離心好后棄除上清液。

接種：根據細胞量以適量的完全培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，之后按適當比例接種到新培養(yǎng)瓶或皿中（細胞量及培養(yǎng)瓶或皿的規(guī)格可按實驗要求確定）。 

【細胞凍存】

細胞收集：?貼壁細胞：當細胞生長至培養(yǎng)瓶或皿底面的80%以上匯合度時，棄去培養(yǎng)瓶或皿中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次，然后添加適量的0.25%胰蛋白酶消化液至培養(yǎng)瓶或皿中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后，加入與胰蛋白酶消化液等量（或高于消化液的量）的完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15mL離心管中。?懸浮細胞：直接收集培養(yǎng)瓶或皿中的細胞懸浮液轉移至15mL離心管中。?半貼壁半懸浮細胞：先參考?收集懸浮細胞，再參考?收集貼壁細胞。

離心：收集好的細胞在1000rpm條件下離心3~5min，離心好后棄除上清液。

凍存液重懸：可根據細胞量（需提前計數）向沉淀細胞加入一定量的配制好的細胞凍存液（50%基礎培養(yǎng)基+40%胎牛血清+10%DMSO），混勻后以1mL/管加入凍存管中。

凍存：將凍存管放入裝有異丙醇的的凍存盒中進行梯度降溫，然后放入-80℃冰箱降溫，24h后將凍存管轉入液氮罐中。(若實驗室條件不足，可于冰箱上層4℃放置30min，隨后轉移至下層-20℃冷凍2h，接下來將其放于-80℃超低溫冰箱中過夜，最終將凍存管放置于液氮中以長期保存。

【售后依據】 

收到細胞后，請及時核對培養(yǎng)瓶上標注的細胞名稱是否與訂購的細胞名稱一致以及培養(yǎng)瓶是否有破損或漏液等異常情況，若有異常請及時拍照聯系我們。 

顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照保存（4×，10×，20×各一張）前三天照片為重要售后依據，不提供照片默認收到狀態(tài)良好。

【注意事項】

1、收到細胞后，及時查看產品介紹，確認細胞生長特性，并按照不同生長特性（貼壁、懸浮、半貼壁半懸浮）對細胞進行處理。

2、收到細胞后建議先不要打開培養(yǎng)瓶蓋，75%酒精棉球擦拭T25細胞培養(yǎng)瓶外部。將其放入37℃培養(yǎng)箱中靜置3~4h后，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

3、有些貼壁細胞在快遞運送過程中可能會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可先離心培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基收集脫落細胞，然后加入完全培養(yǎng)基重懸并吹散，加回原培養(yǎng)瓶并補齊培養(yǎng)液，再放到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

4、如收到密閉培養(yǎng)瓶，處理完后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)時要將培養(yǎng)瓶蓋子擰松。

5、所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全柜內操作，并注意防護。所有廢液及接觸過此細胞的器皿需滅菌后方能丟棄。

6、若細胞在操作過程中發(fā)生污染，需對污染的細胞進行滅活方可丟棄。

7、本庫的細胞系（株）僅用于科研工作，未經許可不得用于其他目的，使用者不得將本庫細胞系（株）轉讓給第三者。

【培養(yǎng)建議】

1、骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)條件要求較高，在培養(yǎng)過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值等條件的影響。

2、人BMSC體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的最佳培養(yǎng)狀態(tài)。

3、該細胞可傳代10代左右，6代以內為最佳，建議收到細胞后盡快完成實驗。

4、注意控制胰酶消化時間，長時間消化會影響細胞貼壁及生長狀態(tài)。-

注：收到貨后務必三天內在4×,10×,20×倍鏡下觀察拍照留存,作為售后依據，否則默認收到貨后狀態(tài)良好。